摘要    胆汁的pH条件下(pH =6~8)，应该生成无定形磷酸钙(ACP)，而在胆结石中磷酸钙通常以羟基磷灰石的形式出现．利用谱学方法研究了ACP与胆盐的作用。结果表明，胆盐以胶团的形式与ACP作用，在溶液中形成复合胶团，使其溶解度增加．不同类型胆盐与ACP的作用能力不同：脱氧胆酸钠 ( NaDC )>牛磺胆酸钠( NaTC ) > 胆酸钠 ( NaC )。胆盐与ACP中HPO₄^2-结合钙的亲和能力大于P01-结合钙的亲和能力，使ACP在胆汁的环境下容易转化为羟基磷灰石。 

关键词： 胆结石， 胆盐， 磷酸钙， 红外光谱， 拉曼光谱

中图分类号： 0648

胆结石是世界性的常见病和多发病，就其组成可以分为三类：胆固醇型、色素型和混合型结石，研究表明^［1-2］一无论那一类结石中均含有难溶性的钙盐，如磷酸钙、碳酸钙、胆红素钙和脂肪酸钙等，难溶性的钙盐在胆固醇型结石中一般分布在核心和表面钙化层内，而在色素型结石中不仅如此，还散布于结石各部分中，因此，研究难溶性钙盐在胆汁环境中的形成和组成对于了解胆结石的发生及其预防和治疗具有重要的意义．就难溶性磷酸钙而言，在胆汁的pH范围内(PH =6 -8），应该生成无定形结构的沉淀，组成为Ca_{9 2}(HPO₄)_2-2(PO4)_6-2，其中戈随pH的改变而变化，也就是沉淀中同时含有磷酸根和磷酸一氢根．但是，结石中发现的磷酸钙多以羟基磷灰石的形式存在．胆汁的主要特征成份——胆盐，是一类非常重要的生物表面活性剂，由于它的存在使胆汁具有促进磷脂及胆固醇的溶解及脂肪酸和脂溶性维生素吸收的生物功能．研究表明，胆盐的存在影响无定形磷酸钙沉淀的生成及其向羟基磷灰石转化^［3-4］，如牛磺胆盐可以抑制无定形磷酸钙的形成；甘氨脱氧胆酸钠和甘氨熊脱氧胆酸钠可以阻止无定形磷酸钙转化为羟基磷灰石。胆盐是如何与磷酸钙沉淀，特别是无定形磷酸钙沉淀作用的呢？本文利用红外光谱、拉曼光谱和激光光散射谱对胆盐胶团与无定形磷酸钙的相互作用进行了研究。

1 实验部分

1.1 试剂

    胆酸钠(NaC)、脱氧胆酸钠(NaDC)、牛磺胆酸钠(NaTC)，均为Sigma公司生产的生化试剂，纯度大于97%．CaCL₂ Na₃HP0₄、Na₂HP0₄为分析纯试剂．

1.2 制备不同组成和形态的磷酸钙

    将相同浓度（0.1 mol L^-l）的CaCI₂和Na₂HP0₄溶液按3：2的体积比混合沉淀；将相同浓度（0.1mol L^-I )的CaCl₂。和 Na₂HP0₄。溶液分别在 pH =3-4和Ph =6-8的条件下等摩尔混合，前者沉淀陈化一个月，后者沉淀立刻分离，XRD和Raman光谱证明得到晶态的Na₂HP0₄。和CaHPO₄·2H₂0及无定形磷酸钙(ACP)。

1.3 磷酸钙与胆盐作用

    取0.1 mmol ACP、Ca₃（P0₄)：和CaHPO₄·2H₂0分别加入0.1 mol· L^-1的不同类型胆盐NaC、NaDC和NaTC)，磷酸钙与胆盐的比例为1：1、1：2和1：

4．连续搅拌60h后，12000r· min^-1离心分离，沉淀用去离子水洗涤3次。

  1.4 红外光谱和拉曼光谱测定

   磷酸钙与胆盐作用后得到的沉淀在NicoletMagna IR-750傅立叶变换红外光谱仪上用显微红外法测定其红外光谱，分辨率4 cm^-1，测量范围4 000 - 650 cm^-1．在Nicolet Raman 950傅立叶变换拉曼光谱仪上测定其拉曼光谱，激光光源采用近红外光源，Nd: YVO₄。激光器，波长1.064 um，分辨率8 cm^-1，测量范围3 600 - 400 cm^-1．1.5 等离子体发射光谱ICP）分析

    磷酸钙与胆盐作用后离心得到的上层清液在美国Leeman公司的ICP-AES仪上测定其中Ca和P的含量．

1.6 激光光散射谱分析

    上层清液中胶团的平均半径在激光光散射谱仪上测定，12 000 r min^-1离心处理，测试温度25℃，测试角度90^O，介质粘度0. 890 4 mPa·s，介质折光指数1. 332 87，波长514.5 nm.

2 结果与讨论

    从Raman光谱中可以看到图1），合成的三种磷酸钙中Ca₃ (PO₄)₂。只在962 cm-处出现了P0₄^3-的对称伸缩振动谱带【s1：CaHP04 21-LO只在989 cm-1处出现了HPO₄^2-的对称伸缩振动谱带；而ACP同时在962和989 cm^-1处出现了两个谱带，表明其中既含有HPO₄^2-又含有PO₄^3-基团．

 先研究了NaDC分别与Ca₃ (PO₄)₂和CaHPO₄的作用．NaDC浓度为0.1 mol L^-1，高于CMC浓度．起始反应比，即DC/Ca的摩尔比为2：1．作用后上层清液中Ca和P的含量有很大差别 见表1）．NaDC与CaHP0₄作用后溶液中磷含量很高，但钙含量却很低：而与Ca₃ (PO₄)₂作用后溶液中磷的含量远低于与CaHPOi的作用，Ca的含量又远高于

与CaHPO₄的作用，

    从NaDC与Ca₃ (PO₄)₂和CaHP0₄作用后沉淀的红外光谱中（图2），可以看到NaDC与CaHPO。作用后，沉淀中几乎没有PO的特征谱带，出现了很强的DC^-中COO^- ( ~1 550 cm^-1 )和环羟基C-O ( ~1 110 cm^-1)的特征振动峰，表明CaHPO₄全部与NaDC作用，生成了脱氧胆酸配合物沉淀．图3为这种脱氧胆酸配合物沉淀光谱中COO^-反对称伸缩振动峰的二阶导数谱，从中可以看到，该谱带实际上由1 547和1 589 cm^-1两个谱带组成．在我们以前的工作中^［6-8]，研究了Ca²⁺与NaDC的作用，发现当Ca²⁺浓度较低 ( <0.5 mol L^-1 ) 且NaDC浓度大于它的CMC浓度时，Ca2+与NaDC胶团作用生成Na_mCa_n(DC)2_n+m复合配合物沉淀，这种复合配合物中保存着部分NaDC胶团结构，即NaDC胶团与Ca²⁺作用产生沉淀，其红外光谱的特征是同时。

 

2.1 脱氧胆酸钠（NaDC）与Ca₃ (PO₄)₂和 CaHP04的作用

    因为ACP中同时含有HPO₄^2--和PO₄^3-．所以首先研究了NaDC分别与Ca₃ (PO₄)₂和CaHPO₄的作用．NaDC浓度为0.1 mol L^-1，高于CMC浓度．起始反应比，即DC/Ca的摩尔比为2：1．作用后上层清液中Ca和P的含量有很大差别 见表1）．NaDC与CaHP0₄作用后溶液中磷含量很高，但钙含量却很低：而与Ca₃ (PO₄)₂作用后溶液中磷的含量远低于与CaHPOi的作用，Ca的含量又远高于与CaHPO₄的作用，从NaDC与Ca₃ (PO₄)₂和CaHP0₄作用后沉淀的红外光谱中（图2），可以看到NaDC与CaHPO。作用后，沉淀中几乎没有PO的特征谱带，出现了很强的DC^-中COO^- ( ~1 550 cm^-1 )和环羟基C-O ( ~1 110 cm^-1)的特征振动峰，表明CaHPO₄全部与NaDC作用，生成了脱氧胆酸配合物沉淀．图3为这种脱氧胆酸配合物沉淀光谱中COO^-反对称伸缩振动峰的二阶导数谱，从中可以看到，该谱带实际上由1 547和1 589 cm^-1两个谱带组成．在我们以前的工作中^［6-8]，研究了Ca²⁺与NaDC的作用，发现当Ca²⁺浓度较低 ( <0.5 mol L^-1 ) 且NaDC浓度大于它的CMC浓度时，Ca2+与NaDC胶团作用生成Na_mCa_n(DC)2_n+m复合配合物沉淀，这种复合配合物中保存着部分NaDC胶团结构，即NaDC胶团与Ca²⁺作用产生沉淀，其红外光谱的特征是同时出现与Ca配位和与Na配位的COO谱带(1571和1 548 cm^-l)．因此，我们认为NaDC(O.1 mol L^-l)与CaHP0₄作用生成的脱氧胆酸配合物沉淀为Na_mCa_n(DC) _2n+m复合配合物沉淀，其中l548 cm^-l为与Na配位的COO-反对称伸缩振动谱带，1589cm^-1为与Ca配位的COO^-反对称伸缩振动谱带，因此，在上层清液中Ca的含量很低，而P的含量却很高，而NaDC与Ca₃(P0₄)₂作用后，沉淀中却可以看到很强的PO谱带(~1 100 cm^-l)，COO^-的谱带很弱，也就是说只形成了少量的脱氧胆酸配合物沉淀，大部分Ca₃(P0₄)₂没有发生反应．所以上层清液中P的含量比NaDC与CaHP04的作用的含量小。

    上述的红外光谱分析结果表明，由于NaDC与Ca₃(P0₄)₂作用后，沉淀中只含少量的脱氧胆酸配合物．因此，大量的DC仍然存在于溶液中．文献报导^［9］纯NaDC水溶液中，NaDC浓度在CMC以上时，胶团的平均半径约为1.5 nm，聚集数为4，NaDC分子以背靠背的方式聚集成胶团．当溶液中加入大量的NaCl 0.3 mol·L^-l）时，这些小的初级胶团发生再聚集，形成更大的胶团，聚集数为29，并认为这种再聚集是通过初级胶团间的氢键作用形成的．在我们的实验中，激光光散射谱的分析表明，纯NaDC溶液中，NaDC浓度为0.1 mol L^-l时大于其CMC浓度0.01 mol L^-l），胶团的平均直径为1.2 -1.7 nm见表2）．将Ca₃(P0₄)₂ (0.1 mol

L^-l)加入NaDC溶液没有引起胶团的再聚集，胶团的平均直径仍为1.2 -1.4 nm，表明Na3PO。的加入不能改变NaDC胶团的聚集状态；而当NaDC (0.1mol L^-l)与Ca3( P04)：作用后，上层清液中存在一定浓度的钙离子时见表1），胶团的平均半径从原来的1.2 -1.7 nm增到87.6 nm，增加了52倍．可见，钙离子与NaDC小胶团的作用引起了胶团的再聚集，使溶液中胶团的平均半径大大增加．我们认为如图4所示，钙离子通过与NaDC小胶团外露的- COO基团配位，作为桥梁使小胶团间互相连接再聚集成为大胶团．因此，NaDC与Ca₃(P0₄)₂作用后上层清液中钙离子浓度较高。

    表1 NaDC与磷酸钙作用后上清液中钙和磷的含量 

在CaHP0₄体系中，由于CaHP0₄全部与NaDC发生作用，所以溶液中几乎没有DC，钙的浓度也很低，因而溶液中观察不到胶团的存在，

    上述结果表明，当溶液中NaDC浓度高于CMC时，NaDC以胶团形式与磷酸钙中的钙发生作用，一方面形成脱氧胆酸复合配合物沉淀，另一方面通过Ca²⁺桥使溶液中的NaDC胶团再聚集．并且NaDC胶团与CaHPO。的反应性大于Ca₃(P0₄)₂ACP与不同胆盐的作用。

    我们选择不同类型的胆盐，其中NaTC为结合型胆盐，NaDC和NaC为非结合型胆盐，NaDC为二羟基胆盐，NaC为三羟基胆盐．不同胆盐与ACP作用后，由表3可见，上清液中磷的含量：NaDC体系>NaTC体系>NaC体系：钙的含量：NaTC体系>NaDC体系>NaC体系．在NaDC或NaC中钙的含量大大小于磷的，而NaTC中钙的含量与磷相当．随着体系反应物起始摩尔比的增加，上清液中钙和磷的浓度均增加．表明胆盐与ACP发生了作用，使ACP增溶，并且不同的胆盐与ACP的作用程度和方式不同，从而导致上清液中钙、磷浓度及钙磷比的变化．

    从作用后沉淀的红外光谱图图5）可以看到，不同胆盐体系的沉淀中均有很强的PO伸缩振动谱带(~1 100 cm^-l)，表明作用后沉淀中还含有大量的磷酸钙成份．其中在NaDC和NaC体系中还可以看到DC和C-中COO配位的特征谱带（549和1 556 cm^-l），并且NaC体系中该峰的相对强度高于NaDC体系：而NaTC体系沉淀中没有明显的TC配位的特征峰．也就是说，NaDC和NaC与ACP作用分别生成了难溶性的脱氧胆酸和胆酸的配合物沉淀，而NaTC体系没有生成类似的配合物沉淀，因此，在上清液中钙的浓度为NaTC体系>NaDC体系>NaC体系．

    从NaTC与ACP作用后沉淀的Raman光谱图6)可以看到，反应后HPOi的特征谱带989

cm^-l消失了，而POi的特征谱带962 cm^-l还很强．证明ACP中与HPO；结合的钙全部与NaTC

胶团作用，而与POi结合的钙只有少量作用了．所以，上清液中Ca的浓度与P的相当．说明同样在ACP中HPOi结合钙与NaTC的反应性高于P0i结合钙．

    综上所述，当ACP放入胆盐溶液CMC以上浓度），胆盐胶团与固体表面的钙作用，在溶液中形成再聚集胶团，从而增加了ACP的溶解度．因此，当溶液中胆盐的含量增加时，Ca和P的含量必然增加．所以，在表3中我们可以看到，虽然不同胆盐体系的上清液中Ca/P比不同，但是Ca和P的含量均随胆盐含量的增加而升高．

    对于NaDC，当胶团中Ca/Na比超过一定值时，产生复合配合物Na。Ca。(DC)。。+。沉淀，所以ACP与其作用后溶液中Ca的含量远远小于P表3)．而对于NaTC，不形成类似的复合配合物沉淀，而是在溶液中形成以Ca2+桥联的NaTC再聚集胶团，所以溶液中Ca的含量较高，上清液中Ca与P的浓度相当，说明胆盐胶团与HPOi结合钙的亲和能力大于POii结合钙．由于胆盐通过钙与ACP发生作用，所以从上清液中P的含量可以确定上述三种胆盐对ACP的作用能力不同，NaDC>NaTC>NaC．即二羟基胆盐大于三羟基胆盐，结合型胆盐大于非结合型胆盐。

3 结 论

    胆盐与ACP作用，一方面胆盐以胶团的形式与固体表面的钙结合，使其脱离固体表面，直接增加ACP的溶解度；另一方面，胆盐胶团与溶液中的钙离子作用，再聚集为高一级的复合胶团，降低溶液中钙离子的活度，从而间接增加ACP的溶解度．ACP溶解度的增加提高了它的反应性，使其更容易转化为其它稳定的结构形式，此外，胆盐与ACP中HPO₄^2-结合钙Ca²⁺一HPO₄^2-）的亲和能力大于HP0₄^2-结合钙（Ca²⁺一P0₄^3-）的亲和能力，使无定形磷酸钙在胆汁的环境下容易转化为羟基磷灰石．正是由于上述原因，在胆汁的pH条件下(pH =6 -8)，结石中的磷酸钙均以羟基磷灰石的形式存在。