柱前衍生RP － HPLC 测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸的含量

 柱前衍生RP － HPLC 测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸的含量

郑兴1，金东日2

( 1． 延边大学药学院，吉林延吉133002; 2． 延边大学理学院化学系，吉林延吉133002)

摘要: 目的: 建立一种高灵敏的熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量的测定方法。方法: 以吡啶－ 苯甲酰氯为柱前衍生

化试剂，以RP － HPLC( UV) 测定牛磺熊去氧胆酸衍生产物的含量。结果: 冰浴下衍生化反应，密封，室温存放24h。色谱条件C18色谱柱，检测波长235nm; 流动相: 甲醇－ 水－ 四氢呋喃( 90∶ 6∶ 4)为流动相; 线性范围: 2. 8 × 10 － 6 ～ 3. 6 × 10 － 6mg /L，最低检测限14ng，用于熊胆粉实际样品的分析，结果满意。结论: 方法灵敏、准确，为熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸的分析提供了一种方法。

关键词: 牛磺熊去氧胆酸; HPLC; 衍生化反应

中图分类号: R 文献标识码: A 文章编号: 1000 － 1719( 2010) 12 － 2428 － 02

牛磺熊去氧胆酸( TUDCA) 化学名: 2 － { ［( 3α，5β，7 β) － 3，7 － 二羟基－ 24 － 胆甾烷－ 24 － 基］氨基］} － 乙基磺酸，分子式: C26 H45 NO6S，分子量499．69。正品熊胆以牛磺熊去氧胆酸( TUDCA) 为主，同时含有其他胆汁酸。以熊胆为主要成分的药物应用在利胆、保肝、治疗眼病、增加免疫力等方面［1 － 2］。卫生部1996 年规定了熊胆粉的相关标准，以TUDCA 定量，此法在熊胆粉及其制剂的定量标准有许多实际应用［3 － 5］。由于在210nm 的低波长区域检测，仪器噪音高，选择性差，灵敏度低。衍生化方法可以增强TUDCA 紫外吸收，提高测定的选择性和灵敏度。

1 仪器和试剂

日本ShimadzuLC － 6A 高效液相色谱仪，SCL － 6A系统控制器，UV － 6A 型紫外检测器，(IntersilR － ODS

－ 3) C18( 150mm × 4. 6mm，5 μm) ( IntersilR － ODS － 3)C18( 250mm × 4. 6mm，5 μm) ，美国安捷伦HPLC 1100 /MSD 液－ 质联用仪，XW － 80A 漩涡搅拌器，超声波清洗器，高纯氮气。

标准品: 牛磺熊去氧胆酸( 东京化成工业株式会社) ; 吡啶、氯仿、苯甲酰氯为优级纯，经重蒸馏干燥处理; 四氢呋喃、乙腈、甲醇为色谱纯; 水为二次蒸馏水;磷酸二氢钠为分析纯; 熊胆粉为延边大学分析测试中心样品。

2 实验方法

2. 1 试剂配制精密称取TUDCA、以吡啶为溶剂，配成浓度为0. 01mg /L 的贮备溶液，4℃下贮存。精密称取TUDCA 适量，以甲醇为溶剂，配成浓度为0. 0025mg /L 的贮备溶液，4℃下贮存。精密称取熊胆粉适量，以吡啶、甲醇溶解，定容，过滤除去不溶物。

2. 2 衍生化反应用微量取样枪取储备溶液适量于聚丙烯管中，冰浴条件下，加入吡啶、苯甲酰氯，密封后，用漩涡搅拌器搅拌0. 5min，室温存放，24h 后，取出，用氮气吹干剩余反应液，以甲醇定容［6－ 7］。用0. 45μm 微孔滤膜过滤，然后进样3 次，每次10μL。   白芷项下含量测定方法，选用甲醇－ 水( 55∶ 45) 为流动相，分离效果不好; 后采用甲醇－ 水( 68∶ 32) 为流动相，保留时间适宜，分离效果良好。本制剂白芷为部分原粉入药，参照中国药典2005版白芷含量测定项下，本试验选用甲醇作为提取溶剂并对超声提取时间进行考察。结果表明，超声提取30min、40min，欧前胡素提取量明显高于超声20min，分别为0. 3133mg /g， 0. 3199mg /g，含量差异不大，故以超声提取30min 作为供试品溶液提取方法。

 2. 3 色谱质谱条件( IntersilR － ODS － 3 ) C18( 150mm × 4. 6mm，5 μm) 色谱柱，UV 检测器，检测波长235nm; 流动相: 甲醇－ 水－ 四氢呋喃( 90∶ 6∶ 4) ; 柱温:30℃; 流速: 0. 001L /min; 进样量10μL。美国安捷伦HPLC1100 /MSD 液质联用仪，进样模式: 离子化方式:API － ES( －) ，质量范围: 100 ～ 1000m/ z，干燥气: 9L /min( N2) ，干燥气温度: 500℃，雾化器压力:40Psi。

3 结果与讨论

3. 1 衍生化反应TUDCA 有两个羟基，易与酰氯发生亲核反应，在3α，7β 羟基上引入两个苯甲酰基，使TUDCA 带上紫外吸收基团。苯甲酰氯价格低，毒性小，但易与亲核试剂水反应，反应溶剂应预先做除水处理。吡啶是碱性试剂，可以除去反应中生成的盐酸。完全反应后，TUDCA 与衍生化试剂生成一种主要衍生产物，分子式C40 H53 NO8S，分子量707，羟基双取代。

3. 2 衍生化反应条件考察了在冰浴、室温条件下( 18℃) ，衍生化反应的情况，在冰浴条件下，反应时间过长; 由于反应放热，进行了冰浴条件下反应、室温存放的实验，效果满意。分别考察了反应时间在1 ～ 50h的转化产物，24h 已经反应完全，色谱响应值不变，以24h 作为反应时间。分别考察了苯甲酰氯不同浓度， 0. 25、0. 75、1. 25、1. 75、2. 00、3. 50、4. 50、5. 50mol /L 时的反应情况，根据液相色谱分析，选择苯甲酰氯浓度为2. 20mol /L。分别用氮气吹干、减压蒸馏、真空干燥条件下除去剩余试剂，3种处理方法均对结果无影响，真空干燥4h时间除尽剩余试剂; 减压蒸馏30min 时间除尽剩余试剂; 氮气吹干5min 时间除尽剩余试剂，而且简便易行，选择用氮气除去多余试剂。

3. 3 色谱条件的优化分别选用了IntersilR － ODS －3C18( 150mm × 4. 6mm，5μm) ( IntersilR－ ODS － 3) C18( 250mm × 4. 6mm，5μm) 色谱柱用于分析。( IntersilR－ ODS － 3) C18(250mm × 4. 6mm，5 μm) 色谱柱，产物峰在30min 出现，分析时间长。( IntersilR － ODS － 3)C18( 150mm × 4. 6mm，5μm) 20min 可完成分析，选( IntersilR－ ODS － 3) C18( 150mm × 4. 6mm，5μm) 为色谱柱。波长在235nm 时，衍生化产物有最大吸收，选择235nm 作为测定波长。甲醇－水( 90∶ 10) ，甲醇－ 水( 95∶ 5) 时，产物保留强，洗脱不完全。选择甲醇－ 水－ 四氢呋喃(90∶ 6∶ 4) 为流动相时，洗脱能力强，分析时间短，相邻色谱峰达到基线分离。

3. 4 衍生化后色谱图与质谱图图1( B) 为TUPCA衍生化后色谱图，TUDCA 衍生物流出时间t =15. 28min。所含TUDCA 浓度为C = 5. 74 × 10 － 5mg /L，进样5μL( 0. 287μg) 。对衍生产物进行了质谱分析，质谱数据表明，衍生

化主要产物［M － H］－ m/ z 为706，分子量为707，与推断的产物一致。

3. 5 实验方法的验证( 1) 线性关系和最低检测限:取TUDCA 标准溶液不同体积，按照上述衍生化反应和色谱条件进样，以三次平均值为测定结果，以标准溶液浓度对其峰面积进行线性回归，在2. 8 × 10 － 6 ～ 3. 6 ×

10 － 6 mg /L 范围呈良好的线性关系，线性方程A = 4. 481 × 106C － 10779( r = 0. 9991) 。在本实验条件下，以信噪比3∶ 1 时的进样浓度，计算出所含牛磺熊去氧胆酸的质量，最低检测限14ng。

图1 熊胆粉衍生化色谱图( A) 和TUDCA 标准品衍生化色谱图( B)

( 2) 精密度和稳定性考察: 于反应结束后，1 天之内进样，共计5 次，RSD = 0. 35%，1 周之内，每天进样1 次，7天测定的峰面积的RSD = 1. 1%。表明产物稳定性好，符合分析要求。

3. 6 样品测定采用本实验方法对熊胆粉样品进行了衍生化反应和色谱分析，如图1( A) ，出现了两个主要的色谱峰，与标准品比较，1为牛磺熊去氧胆酸衍生产物，2为牛磺鹅熊去氧胆酸衍生产物。采用卫生部熊胆粉的测定标准，缓冲盐为流动相直接测定，用标准品比较两种方法的灵敏度，结果表明，本实验采用的衍生化方法使TUDCA 的测定灵敏度提高两个数量级。

以实际熊胆粉样品1、2、3 分别用衍生法和直接法进样，测定TUDCA 含量，并与测试报告结果比较如下，可见衍生法用于熊胆粉实际样品的测定结果稳定、可靠。

表1 熊胆粉测定结果( %)

序号衍生法直接法测试报告

熊胆粉1 26. 1 25. 6 26. 2

熊胆粉2 24. 3 24. 1 24. 2

熊胆粉3 24. 3 24. 1 24. 2

4 结论

采用通用的反相高效液相色谱法，紫外检测器，吡啶－ 苯甲酰氯做衍生化试剂，探讨了牛磺熊去氧胆酸的分析方法，衍生化反应条件温和，在冰浴下加样，室温下可以定量完成，生成了一种主要产物，测定波长235nm，甲醇－ 水－ 四氢呋喃( 90∶ 6∶ 40) 为流动相，在2. 8 × 10 － 6 ～ 3. 6 × 10 － 6mg /L 线性关系良好，并验证了方法的可行性。与以缓冲盐为流动相的直接测定法相比，灵敏度提高了两个数量级，为熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸高效、灵敏的分析提供了一种方法。

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