关于天然甘氨胆酸和牛磺胆酸的提取研究

    摘要
[目的]建立从牛羊胆汁中分离提纯天然甘氨胆酸和牛磺胆酸的工艺。
[方法]采用盐析、萃取、脱水等生物化学方法和柱层析正交试验筛选天然甘氨胆酸和牛磺胆酸的最佳提取工艺。
[结果]在流动相为氯仿和正丁醇，洗脱比例为3∶2，装样量为3000ml胆汁粗提物，洗脱速度为6～10ml/s时提取量最大。所得产品经薄层层析法、红外光谱扫描法证实为甘氨胆酸和牛磺胆酸。经薄层扫描法测定含量，甘氨胆酸和牛磺胆酸平均纯度分别达98.4%和98.6%;提取方法平均回收率分别为63.7%和67.8%。该提取方法稳定可行，具有原材料丰富、价廉，产品纯度高、活性强等优点，适宜对天然甘氨胆酸和牛磺胆酸进行分离提制。
[结论]建立了适宜对天然甘氨胆酸和牛磺胆酸进行分离提制的提取工艺，为甘氨胆酸和牛磺胆酸的工业化生产奠定了基础。
关键词：甘氨胆酸；牛磺胆酸；牛羊胆汁；提取工艺

    我国将动物胆汁作医药用的历史悠久，早在《司牧安骥集》(约公元907年)、《本草纲目》(1578年)、《元亨疗马集》(1608年)等古籍，及近代诸多医药专著如《民间兽医本草》(1984年)、《中国药典》(2005年)等都有记载和报道。胆汁酸是药用胆汁中的主要成分，是各种胆酸类的总称。各种胆酸类在肝中与甘氨酸或牛磺酸结合，成为甘氨胆酸(Glycocholicacid，GCA)和牛磺胆酸(Taurocholicacid，TCA)，并以钠盐的形式分泌到胆中。甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠作为胆盐的主要成分，在体内与脂肪的消化和吸收有重要的关系。不但能增强脂肪酶的活性，催化脂肪分解，增加脂溶性维生素的吸收，还能促进胆汁的分泌，刺激小肠运动。此外还有一定的镇咳、祛痰、平喘、抗炎及免疫调节作用。目前，从动物胆汁中同时分离提取甘氨胆酸和牛磺胆酸的方法还未见报道。为了进一步发挥动物胆汁的药用价值，分析动物胆汁的有效成分，使动物胆汁得到综合开发利用，笔者采用萃取、柱层析等方法开展了从牛羊胆汁中分离提取纯化有效成分甘氨胆酸和牛磺胆酸的研究。

    1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂。
新鲜牛羊胆汁，由呼和浩特市食品公司屠宰场提供;GCA、TCA标准品，美国Sigma公司;甘氨胆酸样品、牛磺胆酸样品由内蒙古农业大学动物科学与医学学院药理实验室制备，纯度为98%以上;乙醇、活性炭、氯化钠、无水硫酸钠、甲醇、盐酸、三氯甲烷、正丁醇、乙酸、薄层层析硅胶均为AR级试剂;柱层析硅胶，试剂级，由青岛海洋化工厂分厂提供，批号20070309。

1.1.2 主要仪器设备。
CS-930双波长薄层扫描仪，日本岛津公司;SB-011傅立叶变换红外光谱仪，PE公司;HG202-1电热干燥培养箱，内蒙古东风电炉厂;硅胶层析柱，上海同兴生物仪器公司;RE52-4旋转蒸发仪，上海沪西分析仪器厂;ZFQ85A旋转蒸发仪，上海医械专机厂;TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司;离心机:HIMAGCENTRIFUGE，日立株式会社本社工场。

1.2 方法

1.2.1 GCA、TCA的提取纯化。
(1)工艺流程。甘氨胆酸和牛磺胆酸都属结合型胆汁酸，物化性质非常相似，采用萃取、沉淀等一般的分离方法很难将2种物质分离纯化，该研究采用柱层析方法，利用2种物质极性的差别达到分离纯化的目的。
(2)流动相、固定相及流动相洗脱比例的确定。在该项目中，柱层析分离纯化工艺的关键条件包括流动相、固定相、流动相洗脱比例、流动相洗脱速度和装样量等。参考内蒙古农业大学动物科学与医学学院药理实验室提取其他胆汁酸类物质试验结果，确定该试验柱层析流动相为氯仿和正丁醇混合溶液，固定相为硅胶。流动相的比例一般采用TLC技术来确定。用不同比例(V∶V=4∶1、3∶1、3∶2、1∶1)的流动相去展开同一个胆汁酸粗品，找出2种成分比移值(Rf值)相差最大的比例，该比例即为分离这2种成分的最佳流动相比例。
(3)流动相最佳流速和胆汁最佳装样量的筛选。流动相洗脱比例确定后，对工艺影响最大的因素还剩流动相洗脱速度和装样量。该试验对这2个因素展开正交试验筛选，设3安徽农业科学，JournalofAnhuiAgri.Sci.2009，37(15):6832-6834责任编辑张杨林责任校对卢瑶个水平，每个水平3个重复，以GCA、TCA样品提取量作为评价指标。

1.2.2 验证试验。通过正交试验确定了最佳提取工艺后，按照最佳提取条件进行验证试验，以进一步考察工艺的可行性。

1.2.3 测定提取方法回收率。从同一批粗提物中取相同体积的2份，其中一份加入1.0g标准品，2份样品提取工艺相同，分别收集样品按下式进行计算:回收率=加对照品提取量-未加对照品提取量1.0×100%试验平行3次，回收率取平均值。

1.2.4 GCA、TCA样品的定性检测。
(1)薄层层析定性鉴别。以收集瓶中浓缩的GCA和TCA为各自样品，GCA和TCA标准品为各自对照，薄层层析板上点样定性分析。展开剂氯仿∶正丁醇∶乙酸∶水=30∶30∶4∶1，显色剂为浓度20%硫酸。
(2)红外光谱(IR)定性鉴别。分别取GCA和TCA样品1～2mg，与溴化钾混匀后压片，上红外光谱仪进行测定。

1.2.5 薄层扫描法定量检测。将显色后薄层层析板放入CS-930双波长薄层扫描仪进行检测。扫描波长λGCA=420nm，λTCA=400nm，用峰面积计算含量，各进行3次，取均值。

    2 结果与分析

2.1流动相最佳洗脱比例的选择结果应用TLC技术，用不同比例的流动相展开同一胆汁粗提物，Rf值结果见表1。
由表1可知，GCA和TCA的Rf值相差最大的流动相比例为3∶2，所以分离GCA和TCA时流动相应选用氯仿∶正丁醇=3∶2的比例。

2.2流动相流速和胆汁装样量的筛选可知，2因素对GCA提取量影响程度B>A，最佳工艺条件为A2B2组合;对TCA影响程度A>B，最佳工艺条件为A2B2组合。装样量和流速对GCA的提取量均无显著影响(P>0.05);装样量对TCA的提取量有显著影响(P<0.05)，流速无显著影响(P>0.05)。综合考虑提取量、试验可操作性等因素，确定最佳工艺为A2B2，即装样量为3000ml，流速为6～10ml/s。

2.3 定性分析结果

2.3.1 薄层层析法定性分析结果。GCA、TCA样品分别与各自标准品的Rf值一致，初步确认分离提取出的样品为甘氨胆酸和牛磺胆酸。

2.3.2 红外光谱(IR)定性分析结果。取1～2mg样品，用溴化钾压片后进行IR分析，结果表明，GCA、TCA样品在500～4000cm-1吸收峰数目及出峰时间与标准图谱均一致，证实提取出的有效成分是甘氨胆酸和牛磺胆酸。

2.4 薄层扫描法定量分析结果经薄层层析板点样显色后，用薄层扫描仪进行全波长扫描，确定GCA、TCA的纯度分别平均为98.4%、98.6%。

    3 结论与讨论

(1)由于近代科学技术的迅速发展，在天然产物成分的提取分离、结构鉴定和合成途径等方面的研究得到了快速发展。特别是在动物胆汁的研究方面，因其在药理学方面的特殊地位，已成为天然产物研究中的重点之一。该试验以牛羊胆汁为原材料，采用盐析、萃取、脱水、柱层析分离等生物学方法，从牛羊胆汁中连续分离提纯出了高纯度的甘氨胆酸和牛磺胆酸。但试验还待进一步完善，应对甘氨胆酸和牛磺胆酸开展系统的药物学试验，为充分开发利用动物胆汁资源提供理论依据。
(2)该工艺操作简单、设备投资少、原材料丰富、产品质量好、活性强，适宜对天然甘氨胆酸和牛磺胆酸进行分离提制，也为以后甘氨胆酸和牛磺胆酸的工业化生产奠定了基础。