HPLC测蛇胆川贝液中胆酸- 新闻详情：
HPLC测蛇胆川贝液中胆酸
杭州宝积生物小编为您介绍：HPLC测蛇胆川贝液中胆酸含量
蛇胆川贝液是用于治疗咳嗽、除痰的一种糖浆制剂，全国各地广泛生产。它的主要成分为蛇胆汁和川贝母，其中胆汁里的胆酸为主要生理活性成分。对蛇胆川贝液中胆酸的含量测定有紫外分光光度法，薄层扫描法。从蛇胆川贝液中提取胆酸，并对它进行化学衍生，用HPLC法分离和测定。
由于胆酸分子中缺乏共轭双键系统，无近紫外吸收特征。必须将胆酸进行化学衍生化，带上强紫外吸收基团后，才能检测。实验采用1-溴乙酰基苯为衍生化试剂，18-冠醚-6为催化剂，对胆酸进行衍生化，然后用HPLC进行分离，使之与溶剂和过量的衍生化试剂以及其他组分分开，用254nm固定波长检测器检测。
1. 仪器与试剂
高效液相色谱仪（中国科学院上海分院科学仪器厂），YSB-Z型平流泵，DZ-1型紫外检测器（固定波长为254nm），3066型记录仪色谱柱，5mm*150mm，填装YWG-C18,10μm。
对照品：胆酸，苯丙酸诺龙，试剂18-冠醚-6,1-溴乙酰基对硝基苯，蛇胆川贝液。
标准溶液的配制：准确称取胆酸标准品5mg，用甲醇溶解并定容至25mL。
内标液的配制：准确称取苯甲酸诺龙10mg用乙腈加热溶解并定容至25mL。
试液的配制：称取18-冠醚-6 10mg，1-溴乙酰基对硝基苯60mg分别置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容。称取氢氧化钾100mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容。
2. 实验方法
（1） 衍生化反应 精密吸取胆酸标准液或已处理好的样品液适量于反应瓶中，加氢氧化钾溶液200μL，蒸干。在干燥的环境中冷却（烘箱里自然冷却或干燥器中冷却），先加18-冠醚-6，再加1-溴乙酰基对硝基苯试液各200μL，密塞，立即放入已恒温至60.C的烘箱中加热60min，取出冷却后即可进样，进样量10μL。
（2） 流动相系统的选择 选用流动相为甲醇-水（80:20）。
在上述色谱条件下，胆酸的保留时间13.1min，内标本丙酸诺龙的保留时间24.0min。
（3） 标准曲线的绘制 精密吸取胆酸标准液100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL，分别置于不同的反应瓶中，各加氢氧化钾试剂200μL，蒸干后冷却，分别加催化剂和衍生化试剂各200μL，于已恒温至60.C的烘箱里加热40min，冷却至室温后加苯丙酸诺龙内标液各200μL，然后依次进样10μL。
胆酸的峰高hx，苯丙酸诺龙的峰高hs，以hx/hs（A）对进样质量（μg）回归，得回归方程：A=0.729x+0.0486，r=0.999.
回归方程线性良好，并基本通过原点，故样品测定用比较法，最小检测量30ng。
（4） 样品检测 精密吸取蛇胆川贝液20mL、置60mL分液漏斗，用氯仿提取5次，（20mL、20mL、15mL、10mL、10mL）。合并氯仿液，置水浴上回收氯仿后蒸干，残渣用甲醇适量溶解，转移至10mL容量瓶中，用甲醇定容。
精密吸取上述处理好的样品液4mL于反应瓶中，加氢氧化钾试液200μL，蒸干。加催化剂和衍生化试剂各200μL，密塞，在60.C烘箱中加热40min，冷却后加200μL内标液，进样，对照品胆酸同时测定。
（5） 回收率的测定 胆酸氯仿溶液的配制 精密称取胆酸2mg于100mL容量瓶中，加适量的氯仿并超声波振荡，使胆酸完全溶解，用氯仿定容。
精密吸取蛇胆川贝液10mL和20mL，分别置2个分液漏斗中，各加入胆酸氯仿标准液2mL，然后用氯仿萃取（方法同样品提取部分）。从已处理好的提取液中各吸4mL于反应瓶中，惊醒衍生化反应后进样，适量的对照品胆酸标准液同时测定，用内标法计算回收率，结果平均回收率为99.8%，RSD为1.5%。
3. 讨论
胆酸进行衍生化反应，首先与氢氧化钾成盐，然后在18-冠醚-6的催化下，与1-溴乙酰基对硝基苯起衍生化反应。因为冠醚是一种固-液相转移催化剂，所以当把样品液和氢氧化钾蒸干后，应在干燥的环境中使反应瓶冷却，防止吸收空气中的水分而影响衍生化的反应的进行。
胆酸标准液在做标准曲线时是用甲醇溶解的，但在测定回收率时，必须改用氯仿。由于胆酸在甲醇中的溶解度很大（36.56g/L），而甲醇是亲水物质，当蛇胆川贝液的糖浆里有少量甲醇时，胆酸就会进入水相而无法用氯仿提取。配制胆酸的氯仿标准液时，须在超声波中振荡才能完全溶解。
蛇胆川贝液中胆酸的含量测定，使用甲醇或氯仿作提取溶剂，经上述方法衍生，色谱图上均无胆酸峰出现。
实验中也对蛇胆汁中的胆汁酸进行了定性实验，将胆囊置一带塞试管中捣烂，用3mL甲醇浸泡，超声波振荡30min，静置后，吸取上清液1mL进行衍生化，然后进样。
实验结果表明，各峰的保留时间与对照品胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸的保留时间相吻合。胆酸13.1min，鹅去氧胆酸18.0min，去氧胆酸19.5min。说明上述方法也可用于动物胆汁中的胆酸的定量和鉴别。
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